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单细胞测序

10x Visium FFPE 空间转录组测序

10x Visium FFPE 空间转录组测序——无偏检测组织切片基因表达,还原表达基因位置信息

  • 10x Visium FFPE 空间转录组测序:10x Visium FFPE空间转录组产品以高分辨率来展示组织不同位置的基因表达信息,增加信息检测维度。该产品具有样本准备简单、分辨 率高、灵敏度高和无偏检测基因表达等特点。

技术路线

切片

质控

染色成像

探针杂交

建库测序

数据分析

  • 探针杂交

    针对人(>18000基因)和小鼠(>20000基因)mRNA设计特异性探针,每个探针分为左侧探针(LHS)和右侧探针(RHS)两部分:LHS包含read 2 测序引物结合序列和特异性序列,RHS 包含特异性序列和polyA序列。LHS与RHS的特异性序列与mRNA结合后,连接形成完整的探针序列。再经过透化等过程,将探针释放与玻片的Oligo序列结合和延伸,最终构建成完整的文库。

10x Visium 玻片

  • 10x Visium 玻片上的Oligo序列与探针的ployA序列结合和延伸,形成含带有barcode的核酸片段,再连接测序接头。
    10x Visium载玻片包含4个捕获区域(对应4张切片),可制备4个转录组文库;
    每个捕获区域面积为6.5 mm x 6.5 mm, 约有5000个spot;
    每个 spot 位点直径55 μm,含有大量UMI标签,可以覆盖1~10 细胞;

信息分析

数据经过严格质控,采用10x Visium官方分析流程和自主开发分析流程,将染色图像与表达数据相结合,获取空间位置表达信息,确保数据分析准确性和可靠性。
10x Visium FFPE 空间转录组 分析内容
数据处理
数据质控
数据比对
表达定量
Space ranger /Seurat 分析
PCA降维
聚类/降维分析
差异表达分析
小提琴图
聚类热图
t-SNE/UMAP展示
空间位置展示
富集分析
Reactome 富集分析
聚类GO 富集分析热图
KEGG 富集分析
高级分析
Spot 定义
轨迹分析
拷贝数分析
WGCNA共表达
肿瘤特征分析

应用方向

  • 肿瘤学:肿瘤微环境、肿瘤异质性、疾病进展、癌症形态、三级淋巴结构
    免疫学:免疫细胞浸润、免疫细胞基因表达特征、免疫细胞传播
    发育生物学:人类发育过程中空间位置表达、发现组织中与形态相关的基因
    神经科学:绘制脑部细胞层、解析正常和病变区域表达特征
    病理学:增加表达维度的形态学结论、基因表达验证病理准确性

送样建议

样本类型 送样量/样 保存条件 运输条件
FFPE 组织块 1块 密封后,4℃保存 冰袋运输

常见问题

  • 1.为什么选空间转录组测序技术,它能为我们带来什么样的结果?

    • 在生物学中,“空间”这个概念具有非常重要的意义,可以用来描述生物网络的相互作用,例如:
      (1)胚胎发育时期,细胞处于胚胎中的位置不同,有着不同的发育命运,从而形成特定的器官。
      (2)肿瘤的发生,生长,转移及演化与肿瘤所处的微环境有着密切的关系,肿瘤细胞,肿瘤相关的基质细胞(stromal cell)及周围的血管,组织免疫细胞等共同形成了“肿瘤微环境”,肿瘤与环境之间既可以相互促进又可以相互拮抗,因此利用空间转录组对肿瘤微环境的研究对于认识肿瘤的发生,发展,转移和治疗有着重要的意义。 每个细胞处于不同的微环境中,会出现不同的基因表达模式和功能差异。只有结合它们的空间位置信息,才能更好的诠释该类细胞在特定环境下的生物学功能。
  • 2.10x Visium FFPE 空间转录组产品可以适用于哪些样本类型?

    • 10x Visium FFPE 空间转录组空间测序,采用探针杂交后,再捕获建库。目前,10x Visium探针仅限于人和小鼠两个物种。
  • 3.FFPE组织尺寸标准,及尺寸不符的处理办法?

    • 样本截面大小应不超过6.5 mm × 6.5 mm。稍大的组织样本,比如长条状的,长度在1 cm左右,可在组织切片时通过组织划分的方法获得合适大小的切片。
  • 4.样本质检的内容及方法?

    • FFPE切片质检合格后,才能进行空间转录组试验,质检的内容主要包括: (1)组织形态学检测: FFPE H&E 染色观察组织形态上是否完整,比如是否有大的裂痕、褶皱等状态。
      (2)RNA 完整性检测: 收集10~20片FFPE切片提取 RNA,利用安捷伦2100检测RNA片段长度分布。长度大于200 bp的RNA片段占比超过50%,说明质检合格。
      (3)粘附性测试: 每个样本取4张FFPE 切片,在与10x Visium 玻片相同材质的玻片上进行贴片、脱蜡和染色等试验后,观察组织脱片程度。没有脱片或轻微脱片则可继续空间转录组捕获建库。

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