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单细胞RNA和VDJ联合分析揭示儿童急性T白血病演化模式及耐药新机制

2024年1月3日    编辑:尊龙凯时

 

发文单位:中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)竺晓凡/张英驰团队

发表期刊:Blood(IF=20.3)

发表时间:2023年10月6日

研究结果:单细胞多组学技术解析了儿童T-ALL的白血病克隆演化模式,揭示了克隆演化过程中RNA结合蛋白MSI2通过调控癌基因MYC表达诱导化疗耐药的分子机制,同时发现MSI2可以作为潜在的药物研发靶点。

尊龙凯时提供了该文章中的单细胞转录组和单细胞免疫组VDJ的捕获建库测序及分析服务。

 

背景介绍

急性T细胞淋巴细胞白血病(T-ALL)是一类侵袭性儿童血液系统恶性肿瘤,约占儿童急性淋巴细胞白血病的10-15%,因其独特的生物遗传学特征和复杂的分子学发病机制,T-ALL治疗靶点少,相比儿童急性B细胞淋巴细胞白血病(B-ALL)总体疗效较差,复发T-ALL的耐药机制挖掘仍是领域内研究的重点和难点。

 

实验设计

 

主要结果

1.通过综合分析T-ALL中的单细胞转录组和TCR图谱,区分白血病细胞和非白血病T细胞群

作者首先对5对初诊-复发(Dx-Rel)的骨髓单核细胞(BMMC)进行WES测序,证实实验队列中存在突变热点(最常报道的T-ALL驱动突变:PTEN,FBXW7,NOTCH1, EZH2 and NRAS等)。对该样本CD7+分选的BMMC进行5‘单细胞转录组+scTCR测序,共获得109,937个细胞,22个clusters,并且发现其中两个T细胞簇是保守的(cluster9、12),通过单细胞多组学整合分析表明,cluster9和12与疾病分期无关,推测该cluster可能是非白血病T细胞,后续通过差异基因富集分析和sanger测序结果得以验证。

 

1 5例T-ALL患者的Bulk和单细胞多组学分析

 

2. T-ALL微环境中非白血病T细胞的单细胞转录组特征

对两个健康儿童供体(HD)的BMMCs进行CD3+流式分选后,进行scRNA-seq+ scTCR-seq测序,共获得18,562个非白血病T细胞,共得到11个功能性T细胞亚群(图2A-B)。

进一步探究NR-Dx-T(未复发)的样本特征,细胞占比分析表明,NR-Dx-T样本与R-Dx-T样本(诊断时复发)相比,效应CD8 T细胞、增殖CD8 T细胞和γδ T细胞的比例显著增加;且TCR克隆型分析表明在NR-Dx-T中,克隆性TCR比例明显增加,表明白血病浸润性T淋巴细胞存在潜在的活化(图2E),CD8+GNLY+效应T细胞、CD8+增殖T细胞和γδ T细胞的克隆型TCR富集最显著(图2F);差异基因分析和GO功能分析进一步表明:NR-Dx-T样本中存在潜在激活的免疫反应(图2G-H)。

R-Rel-T组与其他三组样本相比,CD8+GZMK+耗竭T细胞的比例显著增加(图2C)。综上,激活的免疫反应可能与白血病治疗有关。

 

2 非白血病T淋巴细胞的单细胞特征

 

3. 从诊断到复发的克隆进化轨迹对比

为了进一步研究白血病进展背后的基因特征变异,作者探究了非早前T细胞急性淋巴细胞白血病(非ETP-ALL)患者的细胞亚群与TCR克隆型的相关性。四名患者的在诊断时的显性诊断亚群减少(T593)或消失(T956, T723, T856),而在复发时具有突发性特征的亚群占主导地位(图3A-D),这表明四名患者从诊断到复发的动态基因特征变异性存在异质性;T723和T956样本中,TCR克隆型从诊断到复发的演变,相应地影响了从诊断到复发的表达模式,表明在化疗的持续压力下,存在主克隆发生改变的克隆“更替shift”(图3A、B、E、F)。而在T593和T856样本中,显性TCR克隆型在诊断和相应的复发样本中是相同的(共享相同的TCR基因型),但它们具有不同的基因特征(图3C, D, G, H),表明白血病复发出现的相对惰性细胞状态和动态表达转变,存在同一主克隆持续存在但转录特征改变的克隆“Drift(漂移)”。接下来,作者对该样本进行单细胞基因组测序,单细胞突变分析表明T723和T956样本中存在明显的显性克隆更替,从诊断到复发过程中存在突变转变。而在T593和T856样本中,从诊断到复发过程中,含有相同的突变类型。综上,四对Dx-Rel样本存在两种截然不同的进化轨迹模式。

 

3 Dx-Rel T-ALL对的单细胞转录组和单细胞TCR谱的克隆进展

 

4. 探究保守TCR克隆在整个疾病过程中的克隆漂移

后续,作者进行了细胞周期分析,结果表明复发时较高比例的克隆处于G1期,与诊断时相比,处于S期的细胞较少,表明复发时克隆漂移后增殖停滞(图4A)。进一步鉴定到了在两名患者的诊断-复发克隆中12个最常见的上调基因,其中RNA结合蛋白Musashi-2 (MSI2)在漂移克隆型中有最突出的差异表达 (图4B-C),将其作为与化疗耐药相关的内在克隆进展的潜在指标。

 

4 保守TCR克隆的克隆漂移探究

 

5. MSI2作为T-ALL的假定治疗靶点

后续在T-ALL细胞系(Jurkat、Molt4和CEM)中,结合分子学实验,发现并证实了MSI2通过转录后调控稳定MYC mRNA及蛋白水平表达。推测化疗过程中MSI2不断上调,会进一步提高包括MYC在内的癌基因蛋白水平表达,导致白血病细胞抗凋亡机制激活和化疗耐药,进而引起白血病化疗缓解后复发。

5 MSI2作为T-ALL的假定治疗靶点

 

结合体外药理模型和小鼠体内实验表明,MSI2功能抑制剂(Ro 08-2750)与T-ALL诱导及巩固化疗中重要的细胞毒药物柔红霉素(DNR)和阿糖胞苷(AraC)具有显著的协同作用,Ro 08-2750联合化疗药物,能够延缓白血病细胞的体内扩增并显著延长白血病模型小鼠生存时间,该发现为儿童T-ALL靶向治疗联合化疗克服耐药及复发提供了新思路。

 

6 MSI2功能抑制剂(Ro 08-2750)与T-ALL诱导及巩固化疗中重要的细胞毒药物柔红霉素(DNR)和阿糖胞苷(AraC)协同抑制小鼠白血病细胞的体内扩增




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