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揭示circRNA编码新蛋白的促癌新机制

2024年2月29日    编辑:尊龙凯时

背景

肝内胆管癌(ICC)易转移且术后复发迅速,预后较差。肿瘤微环境中IL-6(白细胞介素)的异常表达使STAT3磷酸化并转移到细胞核中调控下游靶基因的转录,促进肿瘤细胞生长和转移,且IL-6可以诱导非编码RNA表达促进肿瘤侵袭。具有分子海绵作用的环状RNA(circRNA)作为非编码RNA,部分具有内部核糖体进入位点(IRES),可以招募核糖体诱导蛋白质翻译,是癌症发生和转移的重要标志物。然而,IL-6调控circRNAs等其他机制是否促进肿瘤的发生尚不清楚。来自四川大学华西医院吴泓、曾勇、袁克非课题组,中山大学附属第三医院汪根树课题组在影响因子为17.421的Hepatology杂志上发表文章题目为“IL-6 induced cGGNBP2 encodes a novel protein to promote cell growth and metastasis in intrahepatic cholangiocarcinoma”的研究成果,报道了一种IL-6诱导的circRNA(cGGNBP2),并对其编码的新型蛋白(cGGNBP2-184aa)进行了表征,研究了cGGNBP2-184aa在IL-6/STAT3信号传导和ICC转移中的作用。尊龙凯时在此提供专业的circRNA建库测序和生信分析服务。

 

研究结果

  1. IL-6使cGGNBP2上调,与ICC病人预后相关

ICC患者血清中IL-6水平与较大的肿瘤大小、多发肿瘤数量、淋巴结浸润和不良预后显著相关。对IL-6处理的RBE细胞进行circRNA测序,共鉴定出3951个差异circRNA(3055个已知),9个显著上调,7个显著下调。qPCR、RNaseR对测序结果进行了验证,发现circRNA GGNBP2(cGGNBP2)在IL-6处理的细胞中显著上调。在136对ICC肿瘤组织和癌旁组织中评估cGGNBP2的临床相关性,发现cGGNBP2高表达与血清糖类抗原19-9水平升高、肿瘤大小增大、肿瘤数量增多、淋巴结转移和晚期肿瘤分期显著相关,表明cGGNBP2被IL-6上调,可能作为ICC患者的预后因素。

 


1  circRNA测序结果

  1. DHX9调控cGGNBP2的表达

IL-6处理的细胞进行RNA-seq发现与circRNA形成相关的RBPs DHX9可被IL-6下调;40例ICC患者肿瘤组织中DHX9的表达与血清IL-6水平呈负相关;136例ICC组织中cGGNBP2的表达与DHX9的组织化学评分呈负相关;DHX9沉默使cGGNBP2表达水平显著上调。circRNA的成环机制受到内含子2和6的RCM(反向互补配对)的调控。RIP实验验证DHX9与核内ggnbp2基因pre-mRNA转录本内cGGNBP2的RCM结合从而增强转录后水平cGGNBP2的表达。

2 cGGNBP2成环机制

3.阐明cGGNBP2生物学功能:cGGNBP2在体内外促进ICC细胞生长和转移

体外敲除和过表达实验表明cGGNBP2具有促进细胞增殖和细胞侵袭能力;在体内,cGGNBP2的沉默可显著抑制肿瘤生长,过表达可加速肿瘤生长。小鼠肝移植和肺转移模型中,cGGNBP2基因敲除导致较少的转移灶,相反,增强的cGGNBP2促进转移。因此,cGGNBP2在体内外具有促进ICC细胞生长和转移的功能。

4.新机制挖掘:cGGNBP2编码184个氨基酸的新型蛋白

通过circRNADb数据库鉴定出cGGNBP2的一个具有编码184aa蛋白潜能的高度保守的ORF和IRES序列。质谱分析证实cGGNBP2编码184个氨基酸的蛋白质(cGGNBP2-184aa)。根据其氨基酸序列(KKNKRCQLHSLDTHKPK)制备的抗体能够特异性识别GGNBP2和cGGNBP2-184aa。与cGGNBP2一致,cGGNBP2-184aa可通过IL-6刺激以浓度和时间依赖性方式上调。

3 cGGNBP2的ORF与IRES

5.挖掘蛋白功能:cGGNBP2-184aa在体外促进ICC细胞生长和转移

构建cGGNBP2-184aa-ORF表达载体,以及IRES-MUT载体。免疫荧光实验证实cGGNBP2-184aa主要位于细胞质内。IRES-MUT细胞系中cGGNBP2表达量显著升高,cGGNBP2-184aa基本不变;过表达cGGNBP2-184aa-ORF的细胞系中cGGNBP2-184aa的表达显著增强,而cGGNBP2不变。因此,是cGGNBP2-184aa表达上调而不是IRES-MUT cGGNBP2表达上调促进了ICC细胞增殖和转移。

4 cGGNBP2-184aa促进ICC细胞生长与转移  

6.深入探讨蛋白促进细胞生长的机制研究:cGGNBP2-184aa促进ICC细胞中STAT3磷酸化

IRES-MUT和OE-cGGNBP2过表达稳定细胞系的RNA-seq结果发现292个差异上调基因和240个差异下调基因。功能富集分析表明cGGNBP2-184aa过表达显著激活了JAK-STAT信号通路。STAT3是JAK-STAT途径的关键转录因子, cGGNBP2-184aa过表达显著促进了STAT3在Tyr705位点的磷酸化。亚细胞蛋白组分分析表明cGGNBP2-184aa过表达显著加速磷酸化的STAT3Tyr705的核易位。双荧光素酶报告实验显示,cGGNBP2-184aa表过达显著增强STAT3反应元件的活性。功能得失实验确定cGGNBP2-184aa增强的STAT3Tyr705磷酸化影响细胞增殖、迁移和侵袭,表明IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3形成了一个正反馈回路。

5 cGGNBP2-184aa激活AK-STAT信号通路

  1. 阐明cGGNBP2-184aa上调STAT3Tyr705磷酸化的机制:cGGNBP2-184aa与STAT3相互作用以促进其转录活性

质谱与IP实验发现cGGNBP2-184aa和STAT3之间存在相互作用;共免疫沉淀实验证明STAT3的DNA结合域(DBD)能够结合cGGNBP2-184aa(62-122),cGGNBP2-184aa(62-122)增强了STAT3响应元件的荧光素酶活性和STAT3下游基因的mRNA表达;且cGGNBP2-184aa诱导的细胞增殖和侵袭也归因于cGGNBP2-184aa的相互作用区。总之,cGGNBP2-184aa与STAT3的DBD相互作用,激活JAK-STAT信号,在体外促进细胞增殖和转移。

 

6 IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3正反馈回路

 

8.cGGNBP2-184aa在体内的作用及临床意义

在体内,动物模型试验表明cGGNBP2-184aa的过表达,而不是cGGNBP2,可加速肿瘤生长,促进STAT3的磷酸化以及ICC细胞的肺转移的肝转移。136例ICC患者的STAT3Tyr705磷酸化水平检测结果显示cGGNBP2和STAT3Tyr705磷酸化之间显著正相关;皮下注射IL-6后,与体外结果一致,IL-6刺激增加cGGNBP2-184aa表达和STAT3Tyr705磷酸化,同时抑制体内凋亡程序。注射IL-6中和抗体可逆转IL-6的作用。

 

结论

CircRNA GGNBP2(cGGNBP2)通过IL-6处理以时间和浓度依赖性方式上调。cGGNBP2的生物发生受RNA结合蛋白DHX9调控;cGGNBP2编码的新蛋白-cGGNBP2-184aa在体内外促进ICC细胞增殖和转移。在机制上,cGGNBP2-184aa直接与STAT3相互作用,使STAT3磷酸化,并在调节IL-6/STAT3信号中发挥积极的调节作用。IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3形成一个正反馈回路,以维持IL-6/STAT3信号的结构性激活。cGGNBP2表达升高与ICC患者预后不良相关,并被确定为患者预后的独立危险因素,可作为ICC临床IL-6/STAT3靶向治疗的辅助靶点。 

研究思路

 

参考文献

[1] Li H., Lan T., Liu H.L., et al. IL-6 induced cGGNBP2 encodes a novel protein to promote cell growth and metastasis in intrahepatic cholangiocarcinoma. Hepatology. 2021. doi: 10.1002/hep.32232. 




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