在基因编辑领域，精确、高效地对特定DNA位点进行定向修改一直是科学家们追求的目标。2024年1月31日发表于《Nature Biotechnology》的研究论文“Activation of recombinases at specific DNA loci by zinc-finger domain insertions”，通过分子克隆、ChIP-seq、HiFi等多种技术手段，将锌指DNA结合域（ZFDs）插入到重组酶编码序列中，实现对重组酶靶向性和活性的革命性改进。这一技术不仅将重组酶的定向编辑效率提高了四倍，并消除了哺乳动物细胞中可测量的脱靶活性。该工程化重组酶为基因编辑提供了更高的精确性和效率，展现了其在疗法开发中的巨大潜力。文中ChIP-seq测序服务由尊龙凯时提供。

结果展示
N端和C端的ZF融合提高了重组酶的活性

为了测试DNA结合域的融合是否可以改善Cre型工程重组酶的性质，将ZFD（锌指结构域）融合到这些酶的N端或C端。建立了融合蛋白文库，其中连接物的长度因Brec1和Zif268之间不同数量的柔性GGS重复(2-12)而变化。此外，还创建了一个lox-zif靶点文库，其中Brec1识别位点(loxBTR34 碱基对)和9-bpZif268结合基序之间的间距从0 BP到10 BP不等。此外，包括了Zif268结合序列相对于loxBTR半位点的两种不同取向。为了测试所有276种可能的组合，在大肠杆菌中表达了来自pEVO质粒2的目标位点文库上设计的融合复合体，并通过计算重组与非重组质粒的比率来使用纳米孔测序来量化重组效率。

结果表明，与非融合重组酶相比，连接子长度、靶点间距和方向的最佳组合显示出更高的重组率，这可能是因为ZFD与其位点的结合提供了对DNA的额外亲和力。N-末端和C-末端文库的活性都得到了最大的提高，当连接子的重复数为12×GGS，LOXBTR和ZIF结合基序之间的间隔子长度为5 BP，在低重组酶表达水平的质粒试验中对最佳组合的测试显示，平均重组效率为85%(C-末端Brec1-Zif268在loxBTR-5-ZIF(A)位点融合)，而WT-Brec1在相同条件下平均重组质粒为7%(图1e-g)。因此，ZFD的融合显著提高了工程重组酶的重组效率。

Cre-型重组酶五肽扫描诱变

产生ZF-重组酶融合的另一种可能的方法包括将ZFD序列插入到重组酶的编码序列中。然而，这种插入融合可能会使酶失去功能。为了确定工程重组酶中可以耐受小插入的位置，使用四种不同的重组酶进行了五肽扫描突变。

绘制读数图显示，Cre中的插入在许多位置都是耐受的，反映了该酶对插入突变的稳健性。相反，Cre衍生的重组酶没有表现出相同的模式，更少的区域允许插入这五个氨基酸。然而，Cre、Brec1、D7L和D7R的活性突变体在蛋白质的相同区域含有插入，表明这些区域是潜在的通用插入位点。

插入式ZFD融合产生依赖于ZF的重组酶

在终端融合的基础上，使用高通量筛选方法开发了与ZFD插入融合的体系。在Brec1的278和279残基之间融合了Zif268，使用了两个连接器，每个连接器由1-8个GGS重复序列组成，然后在先前开发的目标位点库的基础上表达了这个融合库。使用纳米孔测序技术对结果的1,472个组合进行了测试。尽管五个氨基酸插入是兼容的，但所有携带插入式Zif268融合的变体在wt loxBTR上均无活性，即使在高重组酶表达水平下也是如此，这表明在G278和S279残基之间插入Zif268破坏了Brec1的活性。

在基于质粒的试验中测试了Zif268 与 8×GGS 连接子融合的最佳变体，以下简称为 Brec1278-Zif268。与筛选结果一致的是，即使在 200 µg ml-1 ?-arabinose 的高诱导水平下，Brec1278-Zif268 融合体在wt loxBTR上的活性也受到了影响，但在 loxBTR-5-zif (B) 位点上却恢复了全部活性。因此，插入式 ZFD 融合产生的重组酶依赖于 ZFD 与其目标序列的结合而具有重组活性。

基因组位点 ZFD 的设计和定向进化

测试了单体（D7L和D7R）与设计的ZFD在相应对称位点（loxF8L和loxF8R）以及包括20个碱基对基因组侧翼序列的扩展版本（loxF8L-flank和loxF8R-flank）上的融合体的活性。与之前的结果一致，没有任何被测试的复合物在loxF8L和loxF8R上显示活性。相反，两个融合体（D7L-ZFL1和D7R-ZFR4）在扩展的目标位点上显示了活性，尽管与非融合的重组酶相比效率较低。为了改进设计的ZFDs，采用成熟的底物连接的定向进化（SLiDE）协议来进行ZFDs的定向进化。创建了随机突变的ZFL1和ZFR4的文库，并将这些文库克隆到一个修改过的进化载体中，其中包含重组酶序列和相应的目标位点。进行了20个循环的突变、选择和反选择，以改善ZFD与侧翼位点的特异性结合，并观察到最终文库在扩展的目标位点上的重组活性显著增加，表明具有改进特性的ZFDs已经进化出来。

D7-ZF 具有更好的应用性能

为了进一步研究 D7-ZF 可能的改进，我们在人类基因组偏离目标 HG2 和 HG2L 上进行了测试，这些偏离目标以前曾报道过被 D7 异源二聚体重组。与 D7 不同的是，D7-ZF 在这些非靶标或其扩展版本（包括 34-bp pseudo-loxF8 位点上游和下游的基因组序列）上没有观察到活性。对 D7 和 D7-ZF 在八个已确定的潜在人类非靶点（HGZF1-8）上进行了测试。D7 重组了其中的两个非靶点（HGZF4 和 HGZF5），而 D7-ZF 在任何一个位点上都没有检测到重组活性，这证明了它的高度特异性，并表明这种方法不会导致新的非靶点。

这些结果表明，在具有治疗潜力的工程化重组酶中插入ZFD融合体可以改善其应用特性。证明了D7-ZF的改进性能，使其成为未来治疗开发的首选候选药物。

ZFD-重组酶融合具有宽松的特异性

RecFlex能够重组一系列类lox位点，包括loxFlex1、loxFlex2、loxFlex3、loxFlex4和loxFlex5，它们每半个位点相差6-9 bp。这些靶点之间只显示出31-54%的序列相似性，这表明RecFlex具有重组数千个不同的靶序列的潜力。通过对人类基因组中出现的loxFlex基序的广泛研究，成功地定位了位于人类X染色体上MECP2基因座(LoxMECP2)内的临床相关的RecFlex样靶位置。

结果表明，通过将宽松的特异性重组酶与插入的ZFD融合，这种方法可以在较短的时间内实现具有部分定制的特异性的工程重组酶的编程。

该研究结果对未来的基因组编辑应用具有重要意义，特别是在开发具有宽松特异性的工程重组酶，可以针对多个位点。本文中宽松特异性重组酶RecFlex是这类酶的原型。虽然RecFlex目前不能成为一种完全可编程的重组酶，但我们设想，放松特异性重组酶库的筛选将识别出可以覆盖人类基因组任何序列的酶，并可以与插入的ZFD结合生成先进的基因组编辑酶。

参考文献：

[1] Mukhametzyanova, L., Schmitt, L.T., Torres-Rivera, J. et al. Activation of recombinases at specific DNA loci by zinc-finger domain insertions. Nat Biotechnol (2024).