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FFPE定量蛋白质组学

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黑色素瘤免疫治疗反应的蛋白质组学揭示线粒体依赖性

Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence ^[1]

研究对象：116个IV期黑色素瘤 FFPE 样本
发表杂志： Cell
影响因子：36.216
发表单位：以色列特拉维夫大学
发表时间：2019年9月19日

一、研究背景

黑色素瘤，又称恶性黑色素瘤，是指有恶性变化的色素斑痣，是一种最致命性的皮肤癌，发病率低，但恶性程度高，转移发生早，死亡率高，早期诊断、早期治疗很重要，主要从免疫治疗的角度被广泛研究，其预后生物标志物的寻找主要依赖于临床基线和病理特征。前期利用组织学和基因组学方法在识别预后生物标志物和揭示抗性机制方面投入了大量精力，最近，大量的转录组学分析进一步推进了潜在生物标志物的预测。但是，众所周知，转录和蛋白水平之间存在较大差异，蛋白质层面能更准确地反映细胞的功能，对癌症分类和生物标志物的识别具有重大影响，但黑色素瘤的深层蛋白质组学研究尚未开展。本文通过黑色素瘤免疫治疗反应的蛋白质组学揭示了线粒体依赖性。

二、研究策略

三、研究结果

1. 黑色素瘤对 TIL 和抗 PD1 治疗应答的蛋白质组学分析
研究者对肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗和抗程序性死亡1（PD1）治疗的黑色素瘤患者进行了定量蛋白质组学研究，共鉴定到10,300个蛋白。经 KEGG 功能注释及二维（2D）注释富集测试发现，两种免疫治疗具有显著的相似性：应答者中与代谢相关的蛋白、参与抗原呈递的蛋白以及一些参与信号转导的蛋白高度富集；而无应答者中剪接体和 RNA 代谢相关的蛋白高度富集（图1A、1B）。此外，两个队列的加权基因相关网络分析（WGCNA）也显示了应答者中抗原呈递、IFNG信号以及线粒体代谢途径的富集（图1C）。以上结果说明，线粒体代谢的差异通常与免疫治疗应答有关，而与治疗方案无关。图1 免疫治疗应答者和非应答者之间的功能差异
2. 免疫治疗应答蛋白标志物的鉴定
为筛选免疫治疗的蛋白应答标志物，研究者将基于支持向量机（SVM）的分类和基于方差分析的特征选择嵌入到递归交叉验证过程中，并进行T检验，在两个队列的应答者和无应答者之间共发现160个显著变化的蛋白质，包括 10个PD1特征蛋白质（主要与组织相容性复合物（MHC）相关，图中黄色部分）和3个 TIL 特征蛋白质（ACAT1、ACOT1/ACOT2 和 HADHA，图中蓝色部分）（图2D）。图2 免疫治疗反应的蛋白质特征
3. 特征代谢蛋白表达水平验证
研究者利用免疫组织化学（IHC）对 TIL 的3种特征代谢蛋白（ACAT1、ACOT1 和HADHA）的空间表达进行了研究，发现应答者高于无应答者（图3A和3B）。线粒体标记和电子传输链（ETC）组分琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基（SDHA）的染色显示，应答者的线粒体显著增加，且 CD8 或 CD3 T细胞与特征蛋白 ACOT1、ACAT1 和 HADHA 高度相关（图3C、3D），这与患者所获得较好的治疗结果一致。图3 代谢蛋白和T细胞浸润的组织水平验证
4.黑色素瘤细胞免疫原性代谢调控的功能验证
用二氯乙酸（DCA）处理4个黑色素瘤细胞株以诱导线粒体呼吸增加，发现参与抗原呈递的多种蛋白质表达水平升高。并且，DCA处理增加了细胞表面人类白细胞抗原（HLA）以及 mRNA 的表达（图4B~4D）。使用 CRISPR-CAS9 系统敲除 WM264-4 和 MEL526 黑色素瘤细胞系中的2个TIL标志基因ACAT1和HADHA，蛋白质组学分析显示，抗原呈递、IFN 信号和呼吸电子传递链（ETC）途径在对照组而非敲除组显著富集（图4E）。以上结果说明，线粒体的代谢增强了参与抗原呈递的多种蛋白质表达，增加了肿瘤免疫原性。图4 抗原呈递的代谢控制

参考文献

Michal Harel, Rona Ortenberg, Siva Karthik Varanasi, et al. Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence[J]. Cell, 2019, 179(1): 236-250.