1. 收样前注意事项

2. 寄送样本类型

• 2.1 血清

  1）血液收集在离心管或真空采血管中（不含抗凝剂、防腐剂或者分离剂）室温静置 30-60 min或 4°C 过夜；
  2）1,500 rpm，离心 15 min，仔细收集上清；
  3）分装保存，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
  注意：采血时请使用不加抗凝剂的真空采血管（红色盖头）。血清参考得率：30%-50%。避免溶血。

• 2.2 血浆

  1）使用含有 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂的抗凝管采集血样；
  2）采集 30 min 内，2,000 rpm，离心 15 min。仔细收集上清；
  3）分装保存，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
  注意：推荐使用 EDTA 抗凝管（紫色头盖）。需提前与销售沟通查清所需使用试剂盒对抗凝剂是否有特殊要求。血浆参考得率：约 50%。

• 2.3 尿液

  1）用无菌管收集晨起中段尿；
  2） 2,000 rpm，离心 20 min；
  3） 仔细收集上清，分装保存。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

• 2.4 脑脊液、胸腹水

  处理及保存方法与尿液处理及保存方法相同。

• 2.5 细胞培养上清

  1）检测细胞分泌性成份时，用无菌管收集上清；
  2） 2,000 rpm，离心 20 min；
  3）仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
  注：血清中含有部分细胞因子，所以建议制备无血清或低血清条件培养基。例如，于培养皿或培养板中加入完全培养基，接种细胞；细胞贴壁后，加入含药物的6- 8 ml无血清或低血清（低于2%胎牛血清）培养基作用细胞；待药物作用时间点到达时,确保细胞数目足够多（数量约为10⁶-10⁷ ），收集培养上清于15ml离心管中，2000rpm、4℃离心10min，收集上清，分装于1.5 mL EP管，储存于- 80℃中。

• 2.6 细胞裂解

  可选用以下几种方法获得细胞裂解液：
  2.6.1 化学试剂裂解法
      1）检测细胞内成份时需对细胞样本进行裂解。贴壁细胞需要先用胰酶消化后收集，悬浮细胞可直接收集至离心管中；
      2）待药物作用时间点到达时,确保细胞融合度达到90%以上（数量约为10⁶–10⁷ ），1,500 rpm 离心 10 min，吸弃上清；
      3）用PBS (4℃)清洗2次细胞，加入 NP40 或者 RIPA 裂解液裂解细胞（150-200μl细胞裂解液，或者参照您购买的裂解液说明书），13,000 rpm 离心 20 min。
      4）仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
      5）建议裂解蛋白浓度至少2mg/ml以上，上样时稀释倍数约5-10倍，上样浓度建议为500ug/ml。
  注意：
      1）裂解液成份中推荐使用非离子型去垢剂，如 Triton X-100、NP-40 等；
      2）Triton X-100、NP-40 终浓度不宜超过 2%；
      3）避免使用叠氮钠；
      4）裂解液内还原剂如β-巯基乙醇、DTT 等终浓度不宜超过 10 mM；
  推荐的裂解液：

  RIPA Buffer
  Tris pH 7–8	25mM
  NaCl	150 mM
  SDS	0.1% (w/w)
  sodium deoxycholate	0.5% (w/w)
  Triton X-100 or NP-40	1% (w/w)
  Protease inhibitors such as PMSF or cocktail protease inhibitors. Phosphatase inhibitors if relevant

  2.6.2 反复冻融法
      1）用 PBS 稀释细胞悬液，细胞浓度达到 1×10⁶/ml 左右；
      2）通过反复冻融（-20°C 冰冻，室温溶解，反复 3 次），使细胞破裂释放出细胞内成份；
      3）13,000 rpm 离心 20 min；
      4）仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
      5）建议裂解蛋白浓度至少2mg/ml以上，上样时稀释倍数约5-10倍，上样浓度建议为500ug/ml。
  2.6.3 超声破碎法
      1） 取适量 PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂释放出细胞内成份；
      2） 13,000 rpm 离心 20 min；
      3） 仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
  细胞裂解步骤：
      1）将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用，用蒸馏水或者双蒸水稀释。
      2）配制Protease Inhibitor Cocktail：将Protease Inhibitor Cocktail（蛋白酶抑制剂）小管简单离心，然后将盖子打开，加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂。
      3）取20ul配制好的蛋白酶抑制剂，加入到1980ul的1X Cell Lysis Buffer中，混匀，即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞裂解液，备用。
      4）将配制好的2ml细胞裂解液和1X PBS 在冰上预冷；
      5）将细胞板放在冰上进行细胞裂解；
      6）用1xPBS将细胞清洗3次，弃去1X PBS，最后一次要彻底吸干1X PBS；
      7）加入100-200ul裂解液，然后将细胞刮下来，收集到EP管中；
      8）将EP管在冰上放置30min，每隔5-10min涡旋摇匀30s；
      9）冷冻离心机离心14000rpm 10min；
      10）取上清，分装后在-80度冻存，避免反复冻融；
      11）干冰邮寄
  PS:也可以将悬浮细胞离心收集细胞沉淀，然后加适量裂解液进行裂解；
  蛋白酶抑制剂可以使用商业化的蛋白酶抑制剂，按照说明书配制即可；
  或者使用2M PMSF蛋白酶抑制剂: 取6.968 g PMSF溶解在200 ml 酒精(100%)，然后稀释400倍使用。
  采用蛋白定量试剂盒定量制备的细胞裂解液，蛋白浓度至少大于5mg/ml。

• 2.7 组织匀浆

  （1）切割样本后，称取重量，如果组织上有血液残留，用预冷生理盐水或 PBS 洗净；
  （2）加入一定量的 NP40 或者 RIPA 裂解液，建议20 mg - 100 mg 组织加入500μl裂解液（或者参照您购买的裂解液说明书），液氮迅速冷冻保存备用； 组织裂解步骤：
    一 裂解液的配制
      1）将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用，用蒸馏水或者双蒸水稀释。
      2）配制Protease Inhibitor Cocktail：将Protease Inhibitor Cocktail（蛋白酶抑制剂）小管简单离心，然后将盖子打开，加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂。
      3）取20ul配制好的蛋白酶抑制剂，加入到1980ul的1X Cell Lysis Buffer中，混匀，即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞/ 组织裂解液，备用。
  注：蛋白酶抑制剂可以使用商业化的蛋白酶抑制剂，按照说明书配制即可；或者使用2M PMSF蛋白酶抑制剂: 取6.968 g PMSF溶解在200 ml 酒精(100%)，然后稀释400倍使用。
    二 组织裂解
      4）将配制好的细胞/ 组织裂解液和1X PBS 在冰上预冷；
      5）从-80度冰箱取出冰冻组织，取100 mg组织，用手术剪刀将其剪碎至1-3 mm⁶，转移至2ml离心管，加入200ul细胞裂解液，置冰上保持低温，匀浆机裂解组织，30s-5min（根据具体组织而定）。
      6）冷冻离心机离心14000rpm 10min；
      7）取上清，分装后在-80度冻存，避免反复冻融；
      8）干冰邮寄
    注：采用蛋白定量试剂盒定量制备的组织裂解液，蛋白浓度至少大于5mg/ml。

• 2.8 粪便提取液

  1）使用液氮对粪便样品进行速冻；
  2）解冻后将样品均化，并将 50 至 100 mg 样品转移到离心管中（离心管事先称重）；
  3）通过称重确定粪便的质量，加入样品稀释剂，稀释比例 1:20；
  4）使用涡旋混合管内容物，使用并以 3,000 g 离心 10 min。
  5）收集上清液并测试毒素。

• 2.9 外泌体

  可选用以下几种方法提取外泌体：
  2.9.1 差速离心法
      1）收集细胞上清或生物液体放入离心管中，300g，4°C离心10min，去除细胞，收集上清；
      2）收集的上清2,000g，4°C离心20min，去除细胞和死细胞，收集上清；
      3）收集的上清10,000g，4°C离心30min用以去除细胞碎片，收集上清；
      4）收集的上清100,000g，4°C离心70min，去除上清，收集沉淀（外泌体的粗提物）；
      5）将沉淀在冷的PBS缓冲液中重悬，100,000g，4°C离心70min，去除上清；
      6）将沉淀用50-100?L的冷的PBS重悬，100,000g，4°C离心70min，将上清去除，再沉淀用20-50?L的冷的PBS重悬；
      7）-80°C冻存。
  可选方法：细胞培养上清或生物液体300g，4°C离心10min。收集上清并用0.22?m的过滤器过滤去除细胞碎片等污染物。然后100,000g，4°C离心70min，收集沉淀得到外泌体的粗提物。各管用1mL冷的PBS缓冲液悬起并汇集到一起。再次100,000g，4°C 离心70 min，去除上清后用 500 ?L 冷的 PBS 缓冲液悬起，分装 100 ?L/管，-80°C 冻存。
  2.9.2 蔗糖密度梯度法
      1）取35mL培养完的带有细胞的培养基，300g离心10min去除细胞重复一次；
      2）将第一步得到的上清再依次以1,200g离心10min两次，10,000g离心30min，70,000g离心60min，去上清；
      3）获得的沉淀用5mL2.5M蔗糖，20mMHepes/NaOH，pH7.2的溶液重悬；
      4）线性蔗糖梯度（2-0.25M蔗糖，20mMHepes/NaOH，pH7.2）层叠在外泌体的悬浮液上方，10,000g离心15h；
      5）吸取带有外泌体的蔗糖密度梯度带后，用PBS稀释到3mL，200,000g，4°C离心60min；
      6）去上清，用50-100?LPBS重悬得外泌体。
  2.9.3 免疫磁珠法
      1)前面按细胞培养基准备方法操作，将培养基转移到50mL离心管中，2,000g，4°C离心10min；
      2)将培养基转移到新的50mL离心管中，再次离心；
      3)将磁珠加入到50mL离心管中并加入足量的特定抗体室温静置30min；
      4)利用磁力分离器吸住磁珠并将50mL离心管中的液体排出，从磁力分离器中取出带有磁珠的50mL离心管并加入PBS清洗磁珠两次，得到免疫磁珠；
      5)将第二步得到的培养基加入到带有磁珠的50mL离心管，4°C静置2h；
      6)将50mL离心管放入磁力分离器中移除液体，此时外泌体已吸附在免疫磁珠表面；
      7)用PBS清洗免疫磁珠两次，得到的磁珠外泌体复合物进行后续的分离实验。
  2.9.4 尺寸排阻法
      1）500?L细胞培养基(1,500g离心10min)或者1mL处理过的血浆（10,000g离心20min）过qEV尺寸排阻柱子，用PBS洗脱；
      2）每500?L收集到一起，颗粒和蛋白大小分别用TRPS和Bradford测定；
      3）细胞培养基中，高颗粒/低蛋白的组分汇集到一起，并用AmiconUltra-410kDa装置处理到终体200?L（血浆样品先用0.22?m滤器过滤，再进行同样的操作。
  2.9.5 聚合物（PEG）沉降法
  预处理：先将培养物离心去除细胞和碎片，上清用0.22?m滤膜过滤后进行后续实验。
      1）25gPEG(10kDa)在50mL去离子水中超声1h获得均相溶液。PEG溶液在4°C，5,000g离心20min。上清用0.22?m滤膜的注射器过滤作为母液(50%,g/mL)备用；
      2）适量PEG母液与培养物混合成PEG终浓度为10%，4°C孵育30min；
      3）3,000g离心10min，将上清尽量去除，收集外泌体的沉淀；
      4）为了进一步去除残留的血清蛋白或污染蛋白，用PBS悬浮外泌体沉淀；
      5）PEG母液再次加入至终浓度为10%，4°C孵育30min；
      6）4°C，3,000g离心10min；
      7）尽量去除上清，收集沉淀用PBS重悬得外泌体，用于后续实验。
  2.9.6 试剂盒提取
  可选试剂盒：101Bio试剂盒、OptiPrepTM试剂盒、ExoQuickTM试剂盒、ExoQuickTM试剂盒、Exo-spinTM试剂盒
  外泌体提取后，按照1:1加入M-PER(ThermoScientific)裂解液，裂解10min，分装保存于-80°C。

3. 样本需求量

4. 注意事项：