乳腺叶状肿瘤（phyllode tumors，PTs）是乳腺纤维上皮性肿瘤的一种，在日常工作中并不少见，WHO关于其诊断标准的主观性给病理诊断工作带来不少问题，尤其是良性PTs或交界性PTs与乳腺纤维腺瘤（Fibroadenoma，FA）的鉴别诊断问题常令人困惑。2024年2月8日，深圳中医院病理科邵牧民主任，在Clinical and Translational Medicine上发表了题为：“Integrating single-cell and spatial transcriptomes reveals COL4A1/2 facilitates the spatial organisation of stromal cells differentiation in breast phyllodes tumours”的论文，该研究旨在阐明细胞亚群组成和空间结构，并研究PTs病理发生中的诊断标志物，其中本研究中空间转录组测序服务由尊龙凯时提供。

文章内容

01单细胞RNA测序确定了肿瘤基质细胞的亚群

该研究通过单细胞RNA测序分析乳腺良性肿瘤内部的异质性。研究人员收集了新鲜的原发性肿瘤和相邻正常组织，利用单细胞RNA测序发现在肿瘤和正常组织中的基质细胞亚群组成存在显著差异。在正常组织中，观察到两个主要的基质亚群，分别标记有已知的成纤维细胞标志物（如COL1A1）和肌成纤维细胞标志物ACTA2。这些亚群在肿瘤组织中得到了重现，并分别命名为基质tA和基质tB。与基质tA和基质tB细胞紧密聚类的两个附近的基质亚群命名为tA2和tB2，这些基质亚群的细胞比例从边缘相邻正常组织到边缘肿瘤组织、恶性相邻正常组织和恶性肿瘤组织逐渐增加。除此之外，研究人员还发现了与基质细胞紧密聚类的独特细胞，这些细胞表现出与经历上皮间质转化（EMT）的过渡型上皮细胞相似的特征。

02基质亚群呈现出不同的分化轨迹

在乳腺良性肿瘤中，EPs和基质细胞经历了转录变化和分化关系。EPs先于tTEP_later细胞更早发生胞的转录变化。EPs分化为tTEP_early细胞，然后进一步分化为基质tA2和基质tB2细胞。基质tA2细胞明显分化为基质tB2细胞，然后分化为基质tC细胞。基质tB细胞通过另一条分化路径最终分化为基质tC细胞。EPs和TEP细胞是正常组织中最早出现的细胞。在肿瘤组织和正常组织中，基质细胞之间存在转录分化关系。Stroma tC细胞在TEP细胞中上调了一些特征基因的表达。细胞的EMT评分显示从tTEP_early到基质tC细胞逐渐增加。免疫荧光染色显示在一些腺体旁边的细胞中存在EMT，同时表达CK和VIM。EPs高表达KIT，并且在TEP细胞中也有表达。EPs和基质细胞在腺体和上皮组织相邻区域经历了间质转变表达VIM。总结来说，这些发现揭示了乳腺良性肿瘤中EPs和基质细胞的转录变化和分化关系，以及基质细胞中的EMT现象。

03分化和细胞间的合作通过生长因子和胶原蛋白介导

在这项研究中发现胶原蛋白COL1A1/2介导了基质tA细胞与其他细胞之间的强烈相互作用，而COL4A1/2介导了不同分化阶段的基质细胞之间的相互作用。COL4A1/2的表达随着细胞分化逐渐增加，而COL1A1/2的表达没有持续增加。基质细胞的分化程度可以根据COL1A1/2的表达水平进行评分，表明胶原蛋白COL1A1/2在细胞外基质调节中起主要作用。此外，基质细胞表达的胶原蛋白与整合素ITGA1和ITGB1结合，这些整合素在分化的基质细胞中表达水平较高。免疫荧光染色进一步证实了COL4A1在ACTA2标记的基质tB细胞和基质tB2细胞中的高表达，并与ITGA1共定位。研究数据证明了上皮细胞和基质细胞之间也存在密切的通信，其中IGF1和IGF2是重要的信号分子，它们通过与EPs表面的ITGA6和ITGB4受体结合来介导通信。分化的基质细胞持续高表达IGF2，并与EPs之间的ITGA6和ITGB4受体结合。WNT2是基质tA细胞与EPs之间通信的介导因子。还观察到在P1阶段，基质tA细胞表达了CD34，这表明它们靠近腺体。基质tA细胞富集了CAF特征基因，这可能是由于持续的PDGF刺激所致。分化的基质细胞通过JAG1和NOTCH3之间的强烈相互作用与彼此接触。此外，基质细胞可能通过减少或失去MDK配体来规避免疫细胞的监视。

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04ST数据显示组织中分化的基质细胞的空间生长模式

研究使用了10× Genomics Visium平台对新鲜冷冻的肿瘤组织切片以及同一患者相邻的正常组织进行了分析。将切片中的斑点分为不同的区域，并对每个患者的ST数据进行了单细胞RNA测序，以了解细胞在组织中的空间位置。这些分析一致地揭示了最基本的组织结构。通过对每个区域的基因功能富集分析，确认了细胞类型的解析结果的合理性。

P2的ST数据代表了一个较大的组织区域，而P1的ST数据则更详细地描述了腺体和基质。基质tA细胞广泛分布在两个肿瘤组织中，这与ST中富含CAF标记基因的结果一致。EPs细胞位于一些正常腺体中，但也存在于肿瘤基质中。根据tEP向tEP2的转录变化，EPs细胞从基质向ZAE方向生长。IGF1的表达与EP受体的表达重叠，验证了它们之间的空间相互作用。tTEP_early细胞的分布与肿瘤组织中的EPs细胞重叠，而tTEP_later细胞在ZAE方向上显示相同的生长模式。KIT和VIM的染色结果显示TEP细胞也存在于肿瘤基质中，证实了在ST数据中观察到的分布。ST中PDGF及其受体的表达重叠验证了不同分化基质细胞之间通过PDGF进行的细胞间通信。

基质tA2和基质tB2细胞出现在与tTEP_early和tTEP_later相对应的区域中。它们向周围腺体甚至相邻的正常组织渗透。基质tC细胞在ZAE中形成了独特的分布。因此，基质细胞亚群的空间分布和生长模式与它们的分化轨迹一致。进一步的染色结果证实了基质细胞在腺体附近的分布。COL4A2的表达随着基质细胞的空间分化方向增加，并与其受体ITGA1重叠。在来自相同区域的肿瘤组织切片中，COL4A1和ITGA1的染色结果显示了围绕腺体的基质细胞的独特结构。从细胞的表达情况来看，许多ITGA1和COL4A1在腺体细胞外形成了网状结构，其中许多基质细胞高表达这两种蛋白质。证明了第四型胶原蛋白和整合素的结合为基质细胞向腺体的迁移提供了结构通道。此外，由于COL4A1/2通常在基底膜（BM）中表达，COL4A1在良性和边缘性肿瘤的腺体中并未完全标记BM。

05COL4A1/2的表达伴随着基质细胞的分化，并赋予其增殖能力

进一步验证COL4A1/2对基质细胞增殖的影响，使用来自患者的新鲜肿瘤组织制备了原代肿瘤细胞培养物。通过KIT和COL4A2的染色验证，确认了这些细胞为TEP细胞，并验证了它们对COL4A2的表达存在影响。在使用shRNA片段抑制了COL4A1和COL4A2的表达实验中，验证了这两个基因表达的减少导致细胞增殖减少。这些结果进一步支持了COL4A1/2在基质细胞增殖中的功能。

06分化的基质细胞中的活跃转录区域

在这项研究中，通过使用前五个细胞种群特异性转录因子（TFs）以及每个TF的前10个靶基因构建了不同细胞种群之间的调控网络。总体而言，分化的基质细胞（EPs）与转化的上皮细胞（TEP）共享了一些转录因子，特别是tTEP_early细胞。这表明它们在转录调控方面存在相似性。研究发现E2F1和BRCA1编码了tTEP_later细胞特异性的转录因子，并且与之存在密切的调控关系。编码核受体转录因子NR2F2的基因在Stroma tB和Stroma tC细胞中特异表达，并且具有高水平的表达和调控活性。此外，与tEP细胞相比，NR2F2在tEP2细胞中表达水平较高，这表明它与EPs的转录变化相关。NR2F2的靶基因PDGFRB和IGFBP5在P1的分化基质细胞以及P2的Stroma tB细胞中活跃。透射电子显微镜观察显示，与正常乳腺和良性乳腺纤维细胞的细胞核结构相比，恶性乳腺纤维细胞的细胞核增大，核仁增多，粗糙内质网扩展，核糖体数量增多。基质细胞与内皮细胞之间存在紧密的调控关系，并且在腺体附近发现了微血管。综上所述，这些结果表明分化的基质细胞具有高水平的核转录活性，并且内皮细胞同时参与对这些高活性基质细胞的转录调控。

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07验证多个样本中的异质性并评估COL4A1/2的潜在诊断价值

为了研究乳腺纤维瘤（PT）患者内部肿瘤异质性是否反映了患者间的异质性，该研究收集了另一个独立患者群体中的良性、边缘性和恶性患者的肿瘤和邻近正常组织。通过分离上皮和基质组分，使用蛋白质组学和基因表达分析等技术，发现在恶性患者中基质细胞分化的特征基因富集，而上皮细胞的特征基因在恶性患者中富集程度较低。此外，研究发现COL4A1/2的表达与乳腺纤维瘤的恶性进展呈正相关，并在免疫组化验证中得到了证实。

结论

肿瘤基质细胞包含七个亚群。其中，一群广泛分布的癌相关成纤维细胞样基质细胞与经历间质转化的上皮祖细胞之间存在强烈的相互作用。研究鉴定了两个共享上皮祖细胞和间质标记物的基质亚群。推测它们进一步分化为转录活跃的基质亚群，持续表达COL4A1/2。COL4A1/2与ITGA1/B1的结合促进了从基质向周围腺体的生长模式。此外，通过对来自11个PTs的30个样本进行微蛋白组学研究，发现肿瘤内异质性和患者间异质性之间存在一致的转录变化。对97个独立队列进行的免疫组化评估发现，COL4A1/2和CSRP1可以帮助准确诊断和分级。